Muchas Aplicaciones
El método de descompresión de nitrógeno está particularmente bien adaptado para el tratamiento de células de mamíferos y otras limitadas por membrana. También se ha utilizado con éxito para el tratamiento de las células de plantas, para liberar el virus de huevos fertilizados y para el tratamiento de bacterias frágiles. No se recomienda para las células bacterianas sin tratar, pero esta restricción puede ser eliminada mediante el uso de diversos procedimientos de pre tratamiento para debilitar la pared celular. La levadura, hongos, esporas y otros materiales, con paredes resistentes no responden bien a este método.
Aplicaciones y Técnicas
Células de Mamíferos
Hunter y Commerford (1) publicaron un artículo en 1961, que se ha convertido en “recetario” básico para la rotura de los tejidos de mamíferos, por el método de descompresión de nitrógeno. Aunque la mayor parte del trabajo descrito por estos autores se hizo con tejido de rata, también trataron bazo, células blancas, ganglios linfáticos, tumores, timo y otros tejidos para establecer la aplicabilidad general del método. Sus resultados demostraron claramente que las células pueden romperse por este método con mínimo daño físico y químico de los componentes.
H y C obtuvieron la rotura completa a presiones de 1300 psi o más, mientras que las presiones por debajo de 700 psi dejaron células enteras y grupos de células en el homogeneizado. A presiones entre 800 y 1000 psi, se produjeron homogenizados de células libres con los núcleos intactos. Se utilizó una prensa de mano para pre-picar los tejidos antes del tratamiento en el recipiente. Se encontró que la condición de los núcleos era dependiente de la composición de la solución buffer de suspensión. Se obtuvieron buenos resultados con el uso de soluciones isotónicas mientras que se observaron núcleos con inflamación y rotura en células suspendidas en soluciones muy diluidas. Esto se atribuyó a la inflamación osmótica que H y C encontraron que podría ser controlada mediante la adición de sales inorgánicas tales como cloruro de sodio o solutos orgánicos como sacarosa o glicerol. Los núcleos eran extremadamente frágiles cuando el medio de suspensión no contenía calcio, pero se encontró que la presencia tan sólo 0.0002M de cloruro de calcio estabiliza los núcleos. El acetato de magnesio también es útil para este propósito.
Para determinar la extensión del daño a las células lábiles, H y C estudiaron Deoxyribonucleo proteína, DNP, debido a su susceptibilidad a los agentes químicos y al estrés físico, obteniendo recuperaciones de más del 90% de DNP de la fracción nuclear con excelente conservación del material. También compararon las actividades enzimáticas de suspensiones mitocondriales preparados por el método de descompresión de nitrógeno con suspensiones producidas en un homogeneizador PotterElvehjem. No se detectaron diferencias en la actividad de las enzimas.
Dowben, Gaffey y Lynch (2) usaron la técnica de descompresión de nitrógeno para preparar poli ribosomas a partir de células L, fibroblastos, células fetales humanas de líquido amniótico, hígado de rata y músculo de embriones de pollo. Usando una presión de 600 psi obtuvieron algo más del 99.9% de ruptura y recuperaron más del 95% de los núcleos intactos. El rendimiento de polisomas fue dos a tres veces mayor que cuando las células se homogeneizaron en un triturador de tejidos Dounce. Además, tuvieron perfiles mejor definidos y más reproducibles. También se reportaron actividades significativamente mayores según lo determinado por la incorporación de aminoácidos.
Short, Maines y Davis (4) compararon el método de descompresión de nitrógeno con morteros PTFE y homogeneizadores de tubo de vidrio tipo Potter-Elvehjem para la preparación de las fracciones microsomales para estudios de metabolismo del fármaco. El método de descompresión produjo consistentemente más del doble de proteína microsomal por gramo de tejido, que el mortero y el fraccionamiento del tubo. Se encontró que las actividades enzimáticas por miligramo de proteína microsomal eran esencialmente el mismo para ambos métodos, pero se debe recordar que la descompresión de nitrógeno produjo más del doble de proteína microsomal por gramo de material inicial.
En el examen microscópico se encontró que los homogeneizados producidos por el método de descompresión tenían células libres, mientras que grupos numerosos de células fueron observadas en el mortero y homogeneizado de tubo. La microscopía electrónica de los gránulos microsomales mostró que las partículas eran más pequeñas y más uniformes en tamaño en el método de descompresión. En resumen, estos autores afirman que el método de descompresión de nitrógeno fue más eficiente y probablemente menos variable que el mortero de PTFE y los métodos de tubo de vidrio.
Comparación con métodos de mortero y tubo. En una aplicación reciente en el Hospital de Investigación de Administración de Veteranos en Chicago, un homogeneizado que había requerido ocho horas para producirlo con mortero y tubo, se preparó en quince minutos con un recipiente de rotura celular. En otro laboratorio se homogeneizan hasta 12 kilogramos de cerebro por día con un recipiente de rotura celular.
Wallach y sus asociados (5) han usado el método de descompresión de nitrógeno para obtener el fraccionamiento de célula completa con mínimo daño nuclear. Trabajando con Células de Carcinoma de Ehrlich Ascitis con un buffer de 0.0002M acetato de magnesio, han estudiado la distribución celular de fosfolípidos. Wallach ha publicado muchos otros papeles en los que la técnica de descompresión ha sido utilizada para preparar las membranas celulares.
Preparación de Vacuna
Varios laboratorios comerciales han encontrado que la técnica de descompresión de nitrógeno es extremadamente eficaz para liberar el virus de huevos fertilizados. Este método puede ser ampliado para producción comercial usando recipientes de rotura más grandes que son ofrecidos para tal efecto por Parr.
Células Bacterianas
Fraser (7) en 1951 publicó algunos de los primeros estudios sobre la descompresión de nitrógeno y su efecto sobre la E Coli. El trabajo de Fraser fue limitado debido a que su recipiente estaba limitado a una presión de operación 900 psi. Sin embargo, él fue capaz de obtener un 75% la ruptura en una sola vez y más del 90% ruptura en dos pasos sucesivos usando E Coli recolectada durante la fase de crecimiento logarítmico. Los resultados con otras bacterias y organismos con paredes celulares resistentes han sido mixtos.
Hay varias formas en las que las células bacterianas con paredes resistentes pueden ser tratadas para facilitar su rotura por el método de descompresión de nitrógeno. Estas incluyen: (1) recoger las células durante una fase temprana de crecimiento antes de que se desarrolle la pared completa, (2) cultivar las células en presencia de un agente que inhibe la formación de la pared celular, (3) usando una lisozima para debilitar la pared antes de su procesamiento, o (4) utilizar un pre tratamiento mecánico para debilitar las paredes de las células antes de aplicar el método de descompresión de nitrógeno. Aunque estas técnicas se han aplicado con éxito a muchas bacterias con paredes celulares pesadas, no son igualmente efectivos para la levadura, hongos, esporas y células similares con paredes muy pesadas o duras. Generalmente se requieren vigorosos métodos mecánicos para romper la estructura celular de estos materiales de paredes duras, ya que generalmente no responden bien al tratamiento por el método de descompresión de nitrógeno.
Células de Plantas
Loewus y Loewus (10) han publicado una serie de documentos en los cuales describen la aplicación de los procedimientos de rotura con nitrógeno a células de plantas y células de tejidos de plantas cultivadas. También reportan un éxito considerable en la ruptura de diatomeas por este método.
Referencias
| (1) | Hunter, M. J. and Commerford, S. L., 1961, “Pressure homogenization of mammalian tissues.” Biochim. Biophys. Acta, 47:580- 6. |
| (2) | Dowben, R. M., Gaffey, T. A. y Lynch, P. A., 1968. “Isolation of liver muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogencavitation.” Cartas FEBS, Vol. 2, N° 1, pages 1-3. |
| (3) | Dowben, R. M., Lynch, P. M., Nadler, H. C. y Hsia, D. Y., 1969. “Polyribosomes from L. Cells.” Exp. de Investigación con Células, 58:167-9. |
| (4) | Short, C. R., Maines, M. D. y Davis, L. E., 1972. “Preparation of hepaticmicrosomal fraction for drug metabolism studies by rapid decompressionhomogenization.” Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 140:58-65. |
| (5) | Wallach, D. F. H., Soderberg, J. y Bricker, L., 1960. “The phospholipides ofEhrlich and ascites carcinoma cells composition and intracelfulardistribution.” Cancer Research, 20:397-402. |
| (6) | Manson, L. A., Foshi, G. V. y Palm, J., 1963. “An association oftransplantation antigens with microsomal pipoproteins of normal andmalignant mouse tissues.” J. Cell and ComD. Physiol., 61:109-18. |
| (7) | Fraser, D., 1951. “Bursting bacteria by release of gas pressure.” Nature, 167:33-4. |
| (8) | Avis, P. J. G., 1967. “In subcellular components, preparation andfractionation.” (Ed. Birnie, G. D. and Fox, S. M.) Chapt. 1, Pressurehomogenization of mammalian cells. Published by Plenum Press, Nueva York. |
| (9) | Manson, L. A., 1972 “Extraction of membranous transplantation antigens bypressure homogenization.” (Ed. Kahan, B. D. y Reiifeld, R. A.) Chapt.9,oyransplantation Antigens. Published by Academic Press, Nueva York. |
| (10) | Loewus, M. W. y Loewus, F., 1971. “The isolation and characterization ofd-glucose 6-phosphate cycloaldolase (NDAdependent) from acerpseudoplatanus L. cell cultures. Plant Physiol. (1971) 48:255-260. |